Auflösung und Vergrößerung des Mikroskops. Besser einmal sehen oder superhochauflösende Mikroskopie Was bestimmt die Auflösung eines Elektronenmikroskops?

Richtlinien

Um Objekte zu untersuchen, die klein und mit bloßem Auge nicht zu unterscheiden sind, werden spezielle optische Instrumente verwendet – Mikroskope. Je nach Verwendungszweck werden sie unterschieden: vereinfacht, funktionsfähig, forschend und universell. Je nach verwendeter Beleuchtungsquelle werden Mikroskope unterteilt in: Licht-, Fluoreszenz-, Ultraviolett-, Elektronen-, Neutronen-, Raster- und Tunnelmikroskope. Das Design jedes der aufgeführten Mikroskope umfasst mechanische und optische Teile. Der mechanische Teil dient dazu, Beobachtungsbedingungen zu schaffen – das Objekt zu platzieren, das Bild zu fokussieren, der optische Teil – um ein vergrößertes Bild zu erhalten.

Lichtmikroskopgerät

Ein Mikroskop wird Lichtmikroskop genannt, weil es die Möglichkeit bietet, ein Objekt im Durchlicht in einem hellen Sichtfeld zu untersuchen. (Abb. Außenansicht von Biomed 2) zeigt eine Gesamtansicht des Biomed-2-Mikroskops.

Der mechanische Teil des Mikroskops besteht aus einer Mikroskopbasis, einem beweglichen Tisch und einer Drehvorrichtung.

Die Fokussierung auf ein Objekt erfolgt durch Bewegen des Objekttisches durch Drehen der Grob- und Feineinstellknöpfe.

Der Grobfokusbereich des Mikroskops beträgt 40 mm.

Der Kondensor ist auf einer Halterung montiert und befindet sich zwischen dem Objekttisch und der Kollektorlinse. Seine Bewegung erfolgt durch Drehen des Kondensor-Höhenverstellknopfs. Seine Gesamtansicht ist in (Abb.???) dargestellt. Ein zweilinsiger Kondensor mit einer Blende von 1,25 sorgt für die Ausleuchtung der Felder auf dem Objekt, wenn mit Linsen mit einer Vergrößerung von 4 bis 100 gearbeitet wird.

Der Objekttisch ist auf einer Halterung montiert. Durch Drehen der Griffe ist eine koordinative Bewegung des Objekttisches möglich. Der Gegenstand wird mit Medikamentenhaltern am Tisch befestigt. Die Halter können relativ zueinander bewegt werden.

Die Koordinaten des Objekts und das Ausmaß der Bewegung werden auf Skalen mit einer Teilung von 1 mm und Nonius mit einer Teilung von 0,1 mm gemessen. Der Bewegungsbereich des Objekts in Längsrichtung beträgt 60 mm, in Querrichtung – 40 mm. Kondensator

Kondensator

Das Mikroskop ist mit einer Kondensormontageeinheit mit der Möglichkeit der Zentrier- und Fokussierbewegung ausgestattet.

Das Basismikroskop verwendet einen Universalkondensor, der in einer Halterung installiert ist; Bei Verwendung von Immersionsöl beträgt die numerische Apertur 1,25.

Bei der Einstellung der Beleuchtung erfolgt über die Aperturblende eine sanfte Änderung der numerischen Apertur des das Arzneimittel beleuchtenden Strahlenbündels.

Der Kondensator wird im Kondensatorhalter ortsfest eingebaut und mit einer Feststellschraube gesichert.

Zentrierschrauben des Kondensors werden während der Beleuchtungseinstellung verwendet, um den Kondensor in einer Ebene senkrecht zur optischen Achse des Mikroskops zu bewegen und gleichzeitig das Feldblendenbild relativ zu den Rändern des Sichtfelds zu zentrieren.

Der Griff zum Heben und Senken des Kondensors, der sich auf der linken Seite der Kondensorhalterung befindet, wird zum Einstellen der Beleuchtung verwendet, um auf das Bild der Leuchtfeldblende zu fokussieren.

Die Filter sind in einem rotierenden Ring am Boden des Kondensators installiert.

Optischer Teil des Mikroskops

Besteht aus Beleuchtungs- und Beobachtungssystemen. Das Beleuchtungssystem beleuchtet das Sichtfeld gleichmäßig. Das Beobachtungssystem dient dazu, das Bild des beobachteten Objekts zu vergrößern.

Lichtsystem

Es befindet sich unter der Objekttabelle. Es besteht aus einer im Gehäuse eingebauten Kollektorlinse, die in das Loch im Sockel des Mikroskops eingeschraubt wird, und einer darin eingebauten Fassung mit einer Lampe. Die Lampenfassung ist im Sockel des Mikroskops eingebaut. Die Stromversorgung der Mikroskopbeleuchtung erfolgt über ein Wechselstromnetz über ein dreipoliges Netzkabel, das über einen Stecker mit der Stromversorgung verbunden ist. Die Beleuchtungslampe wird über einen Schalter an der Basis des Mikroskops eingeschaltet.

Beobachtungssystem

Bestehend aus Linsen, Monokularaufsatz und Okularen.

Linsen

Die Linsen sind der wichtigste, wertvollste und zerbrechlichste Teil des Mikroskops. Vergrößerung, Auflösung und Bildqualität hängen von ihnen ab. Dabei handelt es sich um ein System aus zueinander zentrierten Linsen, die von einem Metallrahmen umgeben sind. Am oberen Ende des Rahmens befindet sich ein Gewinde, mit dem das Objektiv in der Fassung des Revolvers befestigt wird. Die vordere (dem Objekt am nächsten liegende) Linse im Objektiv wird Frontlinse genannt und ist die einzige im Objektiv, die eine Vergrößerung erzeugt. Alle anderen Objektive werden Korrekturlinsen genannt und dienen der Korrektur von Mängeln in der optischen Abbildung.

Wenn ein Strahl aus Lichtstrahlen mit unterschiedlichen Wellenlängen durch die Linsen gelangt, entsteht eine Regenbogenfärbung des Bildes – chromatische Aberration. Eine ungleichmäßige Strahlenbrechung auf der gekrümmten Oberfläche der Linse führt zu einer sphärischen Aberration, die durch eine ungleichmäßige Brechung der zentralen und peripheren Strahlen entsteht. Dadurch erscheint das Punktbild als verschwommener Kreis.

Die im Mikroskop-Kit enthaltenen Objektive sind für eine optische Tubuslänge von 160 mm, eine Höhe von 45 mm und eine Deckglasdicke von mm ausgelegt.

Objektive mit Vergrößerungen über 10-fach sind mit federbelasteten Rahmen ausgestattet, die das Präparat und die Frontlinsen beim Fokussieren auf die Oberfläche des Präparats vor Beschädigungen schützen.

Je nach Vergrößerung kann ein Farbring am Objektivkörper angebracht werden, außerdem:

• numerische Apertur;
• optische Rohrlänge 160;
• Deckglasstärke 0,17, 0 oder －";
• Art des Eintauchens - Öl ÖL (MI) oder Wasser VI;

Mit 0,17 gekennzeichnete Objektive sind nur für die Untersuchung von Präparaten mit Deckgläsern mit einer Dicke von 0,17 mm vorgesehen. Mit 0 gekennzeichnete Objektive sind ausschließlich für die Untersuchung von Präparaten ohne Deckglas vorgesehen. Für die Untersuchung von Präparaten mit oder ohne Deckglas können Objektive mit geringer Vergrößerung (2,5 - 10) sowie Immersionsobjektive verwendet werden. Diese Objektive sind mit einem －-Symbol gekennzeichnet.

Okulare

Das Mikroskopokular besteht aus zwei Linsen: einer Augenlinse (oben) und einer Sammellinse (unten). Zwischen den Linsen befindet sich die Blende. Die Blende blockiert Seitenstrahlen und lässt Strahlen nahe der optischen Achse durch, wodurch der Kontrast des Bildes erhöht wird. Der Zweck des Okulars besteht darin, das von der Linse erzeugte Bild zu vergrößern. Die Okulare verfügen über eigene Vergrößerungen von x5, x10, x12,5, x16 und x20, die auf dem Rahmen angegeben sind.

Die Wahl der Okulare hängt vom verwendeten Linsensatz ab. Bei der Arbeit mit Achromat-, Achrostigmata- und Achrofluar-Linsen empfiehlt es sich, Okulare mit einem linearen Sichtfeld von nicht mehr als 20 mm zu verwenden, bei Planchromat- und Planapochromat-Linsen - Okulare mit einem linearen Sichtfeld von 20; 22 und 26,5 mm.

Zusätzlich kann das Mikroskop mit einem WF10/22-Okular mit Skala ausgestattet werden; Der Skalenteilungswert beträgt 0,1 mm.

Eigenschaften von Mikroskopen

Mikroskopvergrößerung

Zu den Hauptmerkmalen eines Mikroskops gehören Vergrößerung und Auflösung. Die Gesamtvergrößerung eines Mikroskops ist definiert als das Produkt aus Objektivvergrößerung und Okularvergrößerung. Allerdings gibt die Vergrößerung keinen Aufschluss über die Qualität des Bildes; es kann klar oder unklar sein. Die Klarheit des resultierenden Bildes wird durch die Auflösung des Mikroskops charakterisiert, d. h. die kleinste Größe von Objekten oder deren Teilen, die mit diesem Gerät sichtbar sind.

Die Gesamtvergrößerung Г des Mikroskops während der visuellen Beobachtung wird durch die Formel bestimmt: Г = βok × βok, wobei:

βrev – Objektivvergrößerung (auf dem Objektiv markiert); βok – Okularvergrößerung (auf dem Okular markiert).

Der Durchmesser des im Objekt beobachteten Feldes, Add mm, wird durch die Formel bestimmt: Add = Add × βob. Doc – Durchmesser des Okularsichtfeldes (auf dem Okular markiert) mm. Die berechneten Werte der Mikroskopvergrößerung und des Durchmessers des beobachteten Feldes am Objekt sind in Tabelle 3 angegeben.

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Mikroskopauflösung

Die Auflösung eines Mikroskops wird durch den minimalen (Auflösungs-)Abstand zwischen zwei getrennt sichtbaren Punkten (oder zwei dünnsten Linien) bestimmt und nach der Formel berechnet

D=λ/(A1+A2) , wobei d der minimale (auflösende) Abstand zwischen zwei Punkten (Linien) ist; λ ist die Wellenlänge des verwendeten Lichts; A1 und A2 sind die numerische Apertur des Objektivs (auf dem Rahmen angegeben) und des Kondensors.

Sie können die Auflösung auf folgende Weise erhöhen (d. h. den Absolutwert von d verringern, da es sich um Kehrwerte handelt): Beleuchten Sie das Objekt mit Licht mit einer kürzeren Wellenlänge λ (z. B. ultraviolette oder kurzwellige Strahlen), verwenden Sie Objektive mit größerer Blende A1 oder Kondensor A2 mit größerer Blende.

Arbeitsabstand des Objektivs

Mikroskope sind mit vier abnehmbaren Objektiven mit eigenen Vergrößerungen von 4×, 10×, 40× und 100× ausgestattet, die auf einem Metallrahmen markiert sind. Die Vergrößerung des Objektivs hängt von der Krümmung der Hauptfrontlinse ab: Je größer die Krümmung, desto kürzer die Brennweite und desto größer die Vergrößerung. Dies ist beim Mikroskopieren zu beachten: Je größer die Vergrößerung des Objektivs ist, desto kleiner ist der freie Arbeitsabstand und desto tiefer sollte es über die Objektebene abgesenkt werden.

Eintauchen

Alle Objektive sind in Trocken- und Immersionsobjektive oder Tauchobjektive unterteilt. Eine Linse wird als trocken bezeichnet, wenn sich zwischen der Frontlinse und der betreffenden Probe Luft befindet. In diesem Fall wird aufgrund des Unterschieds im Brechungsindex von Glas (1,52) und Luft (1,0) ein Teil der Lichtstrahlen abgelenkt und gelangt nicht in das Auge des Betrachters. Trockensystemobjektive haben typischerweise eine lange Brennweite und bieten eine geringe (10-fache) oder mittlere (40-fache) Vergrößerung.

Als Immersions- oder Tauchlinsen werden Linsen bezeichnet, bei denen zwischen der Frontlinse und der Probe ein flüssiges Medium mit einem Brechungsindex nahe dem Brechungsindex von Glas angeordnet ist. Als Immersionsmedium wird meist Zedernöl verwendet. Sie können auch Wasser, Glycerin, transparente Öle, Monobromnaphthalin usw. verwenden. In diesem Fall wird ein homogenes (homogenes) Medium zwischen der Frontlinse des Objektivs und dem Präparat (Glas des Präparats – Öl – Linsenglas) hergestellt den gleichen Brechungsindex. Dadurch gelangen alle Strahlen ohne Brechung oder Richtungsänderung in die Linse und schaffen so Bedingungen für die beste Ausleuchtung des Arzneimittels. Der Wert (n) des Brechungsindex beträgt 1,33 für Wasser, 1,515 für Zedernöl und 1,6 für Monobromnaphthalin.

Mikroskopietechnik

Das Mikroskop wird über ein Stromkabel an das Stromnetz angeschlossen. Mithilfe eines Revolvers wird eine Linse mit 10-facher Vergrößerung in den Strahlengang eingebaut. Ein leichter Anschlag und das Klickgeräusch der Revolverfeder zeigen an, dass das Objektiv entlang der optischen Achse montiert ist. Senken Sie das Objektiv mit dem Grobfokussierungsknopf auf einen Abstand von 0,5 bis 1,0 cm vom Objekttisch ab.

Regeln für die Arbeit mit trockenen Linsen.

Das vorbereitete Präparat wird auf die Bühne gelegt und mit einer Klammer befestigt. Mehrere Sichtfelder werden mit einer ×10-Trockenlinse betrachtet. Der Tisch wird über seitliche Schrauben bewegt. Der zur Untersuchung benötigte Bereich des Arzneimittels wird in die Mitte des Sichtfeldes gelegt. Heben Sie den Tubus an und bewegen Sie durch Drehen des Revolvers die Linse mit einer 40-fachen Vergrößerung, indem Sie von der Seite aus beobachten, und senken Sie den Tubus mit der Linse mithilfe einer makrometrischen Schraube wieder fast ab, bis er mit der Probe in Kontakt kommt. Schauen Sie in das Okular und heben Sie den Tubus ganz langsam an, bis die Umrisse des Bildes sichtbar sind. Die präzise Fokussierung erfolgt mit einer Mikrometerschraube, die in die eine oder andere Richtung gedreht wird, jedoch nicht mehr als eine volle Umdrehung. Wenn beim Drehen der Mikrometerschraube ein Widerstand spürbar ist, bedeutet dies, dass der Hub abgeschlossen ist. Drehen Sie in diesem Fall die Schraube ein bis zwei volle Umdrehungen hinein Rückseite, finden Sie das Bild erneut mit der makrometrischen Schraube und fahren Sie mit der Arbeit mit der mikrometrischen Schraube fort.

Es ist sinnvoll, sich beim Mikroskopieren daran zu gewöhnen, beide Augen offen zu halten und sie abwechselnd zu benutzen, da dies die Sehkraft weniger ermüdet.

Beim Objektivwechsel sollte man nicht vergessen, dass die Auflösung des Mikroskops vom Verhältnis der Apertur des Objektivs und des Kondensors abhängt. Die numerische Apertur des Objektivs beträgt bei 40-facher Vergrößerung 0,65, die des nicht eingetauchten Kondensors 0,95. Es ist praktisch möglich, sie mit der folgenden Technik in Übereinstimmung zu bringen: Nachdem Sie die Probe mit der Linse fokussiert haben, nehmen Sie das Okular ab und decken Sie beim Blick durch den Tubus die Irisblende des Kondensors ab, bis ihre Kanten am Rand der Einheitlichkeit sichtbar werden beleuchtete hintere Linse des Objektivs. Zu diesem Zeitpunkt sind die numerischen Aperturen von Kondensor und Objektiv ungefähr gleich.

Regeln für die Arbeit mit einem Immersionsobjektiv.

Auf das Präparat (vorzugsweise fixiert und eingefärbt) wird ein kleiner Tropfen Immersionsöl aufgetragen. Der Revolver wird gedreht und entlang der zentralen optischen Achse ist ein Immersionsobjektiv mit 100-facher Vergrößerung installiert. Der Kondensator wird bis zum Anschlag angehoben. Die Irisblende des Kondensors ist vollständig geöffnet. Von der Seite aus gesehen senken Sie den Tubus mit einer makrometrischen Schraube ab, bis die Linse in Öl eingetaucht ist, fast bis die Linse den Objektträger der Probe berührt. Dabei muss sehr vorsichtig vorgegangen werden, damit sich die Frontlinse nicht bewegt und beschädigt wird. Sie blicken in das Okular, drehen die Makrometerschraube ganz langsam zu sich hin und heben den Tubus an, ohne die Linse aus dem Öl zu heben, bis die Konturen des Objekts sichtbar sind. Es ist zu beachten, dass der freie Arbeitsabstand im Immersionsobjektiv 0,1 - 0,15 mm beträgt. Anschließend erfolgt die präzise Fokussierung über eine makrometrische Schraube. Bei der Vorbereitung werden mehrere Sichtfelder untersucht, indem der Tisch mit seitlichen Schrauben bewegt wird. Nach Abschluss der Arbeiten mit dem Immersionsobjektiv heben Sie den Tubus an, entfernen das Präparat und wischen die vordere Linse des Objektivs vorsichtig ab, zuerst mit einem trockenen, weichen Baumwolltuch, dann mit demselben Tuch, das jedoch leicht mit reinem Benzin angefeuchtet ist. Es sollte kein Öl auf der Oberfläche des Objektivs zurückbleiben, da es die Ablagerung von Staub ermöglicht und mit der Zeit zu Schäden an der Mikroskopoptik führen kann. Das Präparat wird zunächst mit einem Stück Filterpapier vom Öl befreit, anschließend wird das Glas mit Benzin oder Xylol behandelt.

Wie Sie wissen, erhält ein Mensch den Großteil der Informationen über die Welt um ihn herum durch das Sehen. Das menschliche Auge ist ein komplexes und perfektes Gerät. Dieses von der Natur geschaffene Gerät arbeitet mit Licht – elektromagnetischer Strahlung, deren Wellenlängenbereich zwischen 400 und 760 Nanometern liegt. Die Farbe, die ein Mensch wahrnimmt, wechselt von Lila zu Rot.

Elektromagnetische Wellen, die dem sichtbaren Licht entsprechen, interagieren mit den elektronischen Hüllen von Atomen und Molekülen im Auge. Das Ergebnis dieser Wechselwirkung hängt vom Zustand der Elektronen in diesen Schalen ab. Licht kann absorbiert, reflektiert oder gestreut werden. Was genau mit dem Licht passiert ist, kann viel über die Atome und Moleküle verraten, mit denen es interagierte. Der Größenbereich von Atomen und Molekülen reicht von 0,1 bis zu mehreren zehn Nanometern. Diese ist um ein Vielfaches kürzer als die Wellenlänge des Lichts. Allerdings sind Objekte genau dieser Größe – nennen wir sie Nanoobjekte – sehr wichtig zu sehen. Was muss hierfür getan werden? Lassen Sie uns zunächst besprechen, was das menschliche Auge sehen kann.

Normalerweise, wenn es um die Auflösung des einen oder anderen geht Optisches Gerät, arbeiten mit zwei Konzepten. Das eine ist die Winkelauflösung und das andere die lineare Auflösung. Diese Konzepte hängen miteinander zusammen. Für das menschliche Auge beträgt die Winkelauflösung beispielsweise etwa 1 Bogenminute. In diesem Fall kann das Auge zwei Punktobjekte, die 25–30 cm von ihm entfernt sind, nur dann unterscheiden, wenn der Abstand zwischen diesen Objekten mehr als 0,075 mm beträgt. Dies ist durchaus vergleichbar mit der Auflösung eines herkömmlichen Computerscanners. Tatsächlich bedeutet die Auflösung von 600 dpi, dass der Scanner Punkte unterscheiden kann, die nur 0,042 mm voneinander entfernt sind.

Um Objekte in noch geringerem Abstand voneinander unterscheiden zu können, wurde ein optisches Mikroskop erfunden – ein Gerät, das die Auflösung des Auges erhöht. Diese Geräte sehen anders aus (wie in Abbildung 1 zu sehen), ihr Funktionsprinzip ist jedoch dasselbe. Das optische Mikroskop ermöglichte es, die Auflösungsgrenze auf Bruchteile eines Mikrometers zu verschieben. Bereits vor 100 Jahren ermöglichte die optische Mikroskopie die Untersuchung mikrometergroßer Objekte. Gleichzeitig wurde jedoch klar, dass eine weitere Erhöhung der Auflösung nicht durch eine einfache Erhöhung der Anzahl der Objektive und eine Verbesserung ihrer Qualität erreicht werden konnte. Es stellte sich heraus, dass die Auflösung eines optischen Mikroskops durch die Eigenschaften des Lichts selbst, nämlich seine Wellennatur, begrenzt ist.

Ende des vorletzten Jahrhunderts wurde festgestellt, dass die Auflösung eines optischen Mikroskops . In dieser Formel ist λ die Wellenlänge des Lichts und N Sünde u- die numerische Apertur des Mikroskopobjektivs, die sowohl das Mikroskop als auch die Substanz charakterisiert, die sich zwischen dem Untersuchungsobjekt und dem nächstgelegenen Mikroskopobjektiv befindet. Tatsächlich beinhaltet der Ausdruck für die numerische Apertur den Brechungsindex N Umgebung zwischen Objekt und Objektiv und den Winkel u zwischen der optischen Achse der Linse und den äußersten Strahlen, die das Objekt verlassen und in die Linse eindringen können. Der Brechungsindex des Vakuums ist gleich eins. Für Luft liegt dieser Indikator sehr nahe bei eins, für Wasser bei 1,33303 und für spezielle Flüssigkeiten, die in der Mikroskopie verwendet werden, um maximale Auflösung zu erreichen, N erreicht 1,78. Egal aus welchem ​​Blickwinkel u, der Wert Sünde u kann nicht mehr als eins sein. Daher überschreitet die Auflösung eines optischen Mikroskops nicht einen Bruchteil der Lichtwellenlänge.

Als Auflösung wird im Allgemeinen die halbe Wellenlänge angenommen.

Intensität, Auflösung und Vergrößerung eines Objekts sind verschiedene Dinge. Sie können festlegen, dass der Abstand zwischen den Bildmitten von Objekten, die 10 nm voneinander entfernt sind, 1 mm beträgt. Dies entspräche einer Steigerung um das 100.000-fache. Es wird jedoch nicht möglich sein, zu unterscheiden, ob es sich um ein oder zwei Objekte handelt. Tatsache ist, dass Bilder von Objekten, deren Abmessungen im Vergleich zur Wellenlänge des Lichts sehr klein sind, unabhängig von der Form der Objekte selbst die gleiche Form und Größe haben. Solche Objekte nennt man Punktobjekte – ihre Größe kann vernachlässigt werden. Wenn ein solches Punktobjekt leuchtet, wird es im optischen Mikroskop als heller Kreis dargestellt, der von hellen und dunklen Ringen umgeben ist. Wir werden der Einfachheit halber weiterhin Lichtquellen betrachten. Ein typisches Bild einer Punktlichtquelle, das mit einem optischen Mikroskop aufgenommen wurde, ist in Abbildung 2 dargestellt. Die Intensität der Lichtringe ist viel geringer als die des Kreises und nimmt mit der Entfernung von der Bildmitte ab. Meistens ist nur der erste Lichtring sichtbar. Der Durchmesser des ersten dunklen Rings beträgt . Die Funktion, die diese Intensitätsverteilung beschreibt, wird Punktspreizfunktion genannt. Diese Funktion ist unabhängig von der Vergrößerung. Das Bild mehrerer Punktobjekte besteht genau aus Kreisen und Ringen, wie in Abbildung 3 zu sehen ist. Das resultierende Bild kann vergrößert werden, wenn jedoch die Bilder zweier benachbarter Punktobjekte zusammengeführt werden, verschmelzen sie weiterhin. Diese Art der Vergrößerung wird oft als nutzlos bezeichnet – größere Bilder werden einfach unschärfer. Ein Beispiel für eine nutzlose Vergrößerung ist in Abbildung 4 dargestellt. Die Formel wird oft als Beugungsgrenze bezeichnet und ist so berühmt, dass sie in das Denkmal des Autors dieser Formel, des deutschen optischen Physikers Ernst Abbe, eingraviert wurde.

Natürlich wurden optische Mikroskope im Laufe der Zeit mit einer Vielzahl von Geräten ausgestattet, die die Speicherung von Bildern ermöglichten. Das menschliche Auge wurde zunächst durch Filmkameras und Filme ergänzt, dann durch Kameras, die auf digitalen Geräten basieren, die das auf sie fallende Licht in elektrische Signale umwandeln. Die gebräuchlichsten dieser Geräte sind CCD-Matrizen (CCD steht für Charge-Coupled Device). Die Anzahl der Pixel in Digitalkameras nimmt immer weiter zu, die Auflösung optischer Mikroskope allein kann dadurch jedoch nicht verbessert werden.

Noch vor 25 Jahren schien es, dass die Beugungsgrenze unüberwindbar sei und dass man auf das Licht als solches verzichten müsse, um Objekte zu untersuchen, deren Abmessungen um ein Vielfaches kleiner als die Wellenlänge des Lichts seien. Genau diesen Weg haben die Erfinder der Elektronen- und Röntgenmikroskope eingeschlagen. Trotz der zahlreichen Vorteile solcher Mikroskope blieb das Problem der Verwendung von Licht zur Betrachtung von Nanoobjekten bestehen. Dafür gab es viele Gründe: Bequemlichkeit und Leichtigkeit beim Arbeiten mit Objekten, der kurze Zeitaufwand für die Erstellung eines Bildes, bekannte Methoden zum Einfärben von Mustern und vieles mehr. Nach Jahren harter Arbeit wurde es schließlich möglich, nanoskalige Objekte mit einem optischen Mikroskop zu betrachten. Die größten Fortschritte in dieser Richtung wurden im Bereich der Fluoreszenzmikroskopie erzielt. Natürlich hat niemand die Beugungsgrenze aufgehoben, aber sie haben es geschafft, sie zu umgehen. Derzeit gibt es verschiedene optische Mikroskope, die es ermöglichen, Objekte zu untersuchen, deren Abmessungen viel kleiner sind als die Wellenlänge des Lichts, das Bilder dieser Objekte erzeugt. Alle diese Geräte haben eines gemeinsam allgemeines Prinzip. Versuchen wir zu erklären, um welches es sich handelt.

Aus dem, was bereits über die Beugungsgrenze der Auflösung gesagt wurde, geht hervor, dass es nicht so schwierig ist, eine Punktquelle zu erkennen. Wenn diese Quelle eine ausreichende Intensität aufweist, ist ihr Bild deutlich sichtbar. Form und Größe dieses Bildes werden, wie bereits erwähnt, durch die Eigenschaften des optischen Systems bestimmt. Wenn Sie gleichzeitig die Eigenschaften des optischen Systems kennen und sicher sind, dass es sich bei dem Objekt um ein Punktobjekt handelt, können Sie gleichzeitig genau bestimmen, wo sich das Objekt befindet. Die Genauigkeit der Koordinatenbestimmung eines solchen Objekts ist recht hoch. Dies lässt sich anhand von Abbildung 5 veranschaulichen. Die Koordinaten eines Punktobjekts lassen sich umso genauer bestimmen, je intensiver es leuchtet. Bereits in den 80er Jahren des letzten Jahrhunderts konnten sie mit einem optischen Mikroskop die Position einzelner leuchtender Moleküle mit einer Genauigkeit von 10–20 Nanometern bestimmen. Eine notwendige Voraussetzung für eine solch genaue Bestimmung der Koordinaten einer Punktquelle ist ihre Einsamkeit. Die nächstgelegene andere Punktquelle muss so weit entfernt sein, dass der Forscher sicher weiß, dass das verarbeitete Bild einer Quelle entspricht. Es ist klar, dass dies eine Distanz ist l muss die Bedingung erfüllen. In diesem Fall kann die Bildanalyse sehr genaue Informationen über die Position der Quelle selbst liefern.

Die meisten Objekte, deren Abmessungen viel kleiner sind als die Auflösung eines optischen Mikroskops, können als eine Reihe von Punktquellen dargestellt werden. Die Lichtquellen in einem solchen Satz sind in Abständen voneinander angeordnet, die viel kleiner als sind. Wenn diese Quellen gleichzeitig leuchten, ist es unmöglich, etwas über ihren genauen Standort zu sagen. Wenn man diese Quellen jedoch nacheinander zum Leuchten bringen kann, kann die Position jeder einzelnen von ihnen mit hoher Genauigkeit bestimmt werden. Wenn diese Genauigkeit den Abstand zwischen den Quellen übersteigt, kann man, wenn man die Position jeder einzelnen Quelle kennt, ihre relative Position herausfinden. Dies bedeutet, dass Informationen über die Form und Größe des Objekts gewonnen wurden, die als eine Reihe von Punktquellen dargestellt werden. Mit anderen Worten: In diesem Fall können Sie mit einem optischen Mikroskop ein Objekt untersuchen, dessen Abmessungen kleiner als die Beugungsgrenze sind!

Der entscheidende Punkt besteht also darin, unabhängig voneinander Informationen über verschiedene Teile eines Nanoobjekts zu erhalten. Hierzu gibt es drei Hauptgruppen von Methoden.

Die erste Gruppe von Methoden bringt gezielt den einen oder anderen Teil des Untersuchungsobjekts zum Leuchten. Die bekannteste dieser Methoden ist die optische Nahfeld-Rastermikroskopie. Schauen wir es uns genauer an.

Wenn Sie die Bedingungen, unter denen von der Beugungsgrenze die Rede ist, genau studieren, werden Sie feststellen, dass die Abstände von Objekten zu Linsen viel größer sind als die Wellenlänge des Lichts. Bei Abständen, die mit dieser Wellenlänge vergleichbar und kleiner sind, ist das Bild anders. In der Nähe jedes Objekts, das im elektromagnetischen Feld einer Lichtwelle gefangen ist, befindet sich ein elektromagnetisches Wechselfeld, dessen Änderungsfrequenz mit der Änderungsfrequenz des Feldes in der Lichtwelle übereinstimmt. Im Gegensatz zu einer Lichtwelle lässt dieses Feld schnell nach, wenn es sich vom Nanoobjekt entfernt. Der Abstand, bei dem die Intensität abnimmt, z.B. e Zeiten, vergleichbar mit der Größe des Objekts. Somit konzentriert sich das elektromagnetische Feld optischer Frequenz in einem Raumvolumen, dessen Größe viel kleiner ist als die Wellenlänge des Lichts. Jedes Nanoobjekt, das in diesen Bereich fällt, interagiert auf die eine oder andere Weise mit dem konzentrierten Feld. Wenn das Objekt, mit dessen Hilfe diese Feldkonzentration durchgeführt wird, sequentiell entlang einer beliebigen Flugbahn entlang des untersuchten Nanoobjekts bewegt und das von diesem System emittierte Licht aufgezeichnet wird, kann aus einzelnen auf dieser Flugbahn liegenden Punkten ein Bild erstellt werden. Natürlich sieht das Bild an jedem Punkt so aus, wie in Abbildung 2 gezeigt, aber die Auflösung hängt davon ab, wie stark das Feld konzentriert wurde. Und diese wiederum wird durch die Größe des Objekts bestimmt, mit dessen Hilfe dieses Feld konzentriert wird.

Die gebräuchlichste Methode, das Feld auf diese Weise zu konzentrieren, besteht darin, ein sehr kleines Loch in einen Metallschirm zu bohren. Typischerweise befindet sich dieses Loch am Ende eines spitzen Lichtleiters, der mit einer dünnen Metallschicht beschichtet ist (der Lichtleiter wird oft als optische Faser bezeichnet und wird häufig zur Datenübertragung über große Entfernungen verwendet). Nun ist es möglich, Löcher mit Durchmessern von 30 bis 100 nm herzustellen. Die Auflösung ist gleich groß. Geräte, die nach diesem Prinzip arbeiten, werden optische Nahfeld-Rastermikroskope genannt. Sie erschienen vor 25 Jahren.

Das Wesentliche der zweiten Methodengruppe ist Folgendes. Anstatt benachbarte Nanoobjekte abwechselnd zum Leuchten zu bringen, können Sie Objekte verwenden, die in verschiedenen Farben leuchten. In diesem Fall können Sie mithilfe von Lichtfiltern, die Licht der einen oder anderen Farbe durchlassen, die Position jedes Objekts bestimmen und dann ein einzelnes Bild erstellen. Dies ist dem in Abbildung 5 gezeigten sehr ähnlich, nur dass die Farben für die drei Bilder unterschiedlich sind.

Die letzte Gruppe von Methoden, die es ermöglichen, die Beugungsgrenze zu überwinden und Nanoobjekte zu untersuchen, nutzt die Eigenschaften der leuchtenden Objekte selbst. Es gibt Quellen, die mit speziell ausgewähltem Licht „eingeschaltet“ und „ausgeschaltet“ werden können. Solche Umstellungen kommen statistisch vor. Mit anderen Worten: Wenn es viele schaltbare Nanoobjekte gibt, können Sie durch Auswahl der Wellenlänge des Lichts und seiner Intensität das „Ausschalten“ nur eines Teils dieser Objekte erzwingen. Die verbleibenden Objekte leuchten weiterhin und es kann ein Bild von ihnen erhalten werden. Danach müssen Sie alle Quellen „einschalten“ und einige davon wieder „ausschalten“. Die Menge der Quellen, die „eingeschaltet“ bleibt, unterscheidet sich von der Menge, die beim ersten Mal „eingeschaltet“ blieb. Durch mehrmaliges Wiederholen dieses Vorgangs können Sie Folgendes erreichen: großes Set Bilder, die sich voneinander unterscheiden. Durch die Analyse eines solchen Satzes ist es möglich, einen großen Teil aller Quellen mit sehr hoher Genauigkeit weit oberhalb der Beugungsgrenze zu lokalisieren. Ein Beispiel für eine auf diese Weise erzielte Superauflösung ist in Abbildung 6 dargestellt.

Die hochauflösende optische Mikroskopie entwickelt sich derzeit rasant. Es ist davon auszugehen, dass dieser Bereich in den kommenden Jahren immer mehr Forscher anziehen wird, und wir hoffen, dass auch die Leser dieses Artikels dazu gehören werden.

Elena 3013

In diesem Artikel werden die Vergrößerung eines Mikroskops, die Maßeinheiten dieser Größe und Methoden zur visuellen Bestimmung des Auflösungsvermögens des Geräts erläutert. Wir werden auch über die Standardparameter dieses Werts und Methoden zur Berechnung der Erhöhung für eine bestimmte Art von Arbeit sprechen.

Am häufigsten sind die wichtigsten Leistungsparameter eines Mikroskops auf dem Objektivkörper angegeben. Schrauben Sie das Objektiv ab und überprüfen Sie es. Sie können zwei als Bruch geschriebene Zahlen sehen. Das erste ist die Vergrößerung, das zweite die numerische Apertur.

Die Blende charakterisiert die Fähigkeit des Geräts, Licht zu sammeln und ein klares Bild zu erzeugen. Die Linse kann auch die Länge des Rohrs und die Dicke des Deckglases anzeigen, die für die Aufgabe erforderlich sind.

Alles über Mikroskopvergrößerung

Die Vergrößerung wird in Vielfachen (x) gemessen. Die Beziehung des Okular-Linsen-Systems bestimmt vollständig seine Bedeutung. Das Produkt aus der Vergrößerung von Okular und Objektiv gibt Aufschluss über die Arbeitsvergrößerung, die ein bestimmtes Mikroskop erzeugt. Die Abhängigkeit der Gesamtvergrößerung von der Objektivvergrößerung ist offensichtlich. Basierend auf der Stärke werden Objektive in die folgenden Gruppen eingeteilt:

Klein (nicht mehr als 10x);

Mittel (bis zu 50x);

Groß (über 50x);

Extra groß (mehr als 100x).

Der maximale Objektivvergrößerungswert für ein optisches Mikroskop beträgt 2000x. Der Okularwert beträgt normalerweise 10x und ändert sich selten. Die Objektivvergrößerung variiert jedoch stark (von 4 über 100x und 2000x).

Bei der Auswahl eines Mikroskops müssen Sie berücksichtigen, wer es verwenden wird und welche maximale Vergrößerung möglicherweise erforderlich ist. Für ein Vorschulkind reicht beispielsweise eine 200-fache Vergrößerung; Schul- und Universitätsmikroskope haben eine 400-1000-fache Vergrößerung. Aber das Forschungsgerät sollte mindestens 1500-2000x liefern. Mit diesem Wert können Sie mit Bakterien und kleinen Zellstrukturen arbeiten.

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Geräteauflösung

Was bestimmt die Klarheit und Qualität des von einem Mikroskop erzeugten Bildes? Dies wird durch die Auflösung des Geräts beeinflusst. Um diese Größe zu berechnen, müssen Sie den Quotienten aus der Lichtwellenlänge und zwei numerischen Aperturen ermitteln. Daher wird es durch den Kondensor und das Mikroskopobjektiv bestimmt. Wir erinnern Sie daran, dass der numerische Aperturwert auf dem Objektivtubus zu sehen ist. Je höher dieser ist, desto besser ist die Auflösung des Geräts.

Das optische Mikroskop hat eine Auflösungsgrenze von 0,2 Mikrometern. Dies ist der Mindestabstand zum Bild, wenn alle Punkte des Objekts unterscheidbar sind.

Nützliche Mikroskopvergrößerung

Von einer sinnvollen Vergrößerung spricht man dann, wenn das Auge des Forschers das Auflösungsvermögen des Mikroskops voll ausnutzt. Dies wird dadurch erreicht, dass das Objekt im maximal zulässigen Winkel beobachtet wird. Die nutzbare Vergrößerung hängt nur von der numerischen Apertur und der Art des Objektivs ab. Bei der Berechnung erhöht sich die numerische Apertur um das 500- bis 1000-fache.

Eine trockene Linse (nur Luft zwischen Objekt und Linse) erzeugt eine brauchbare Vergrößerung von 1000x, also NA ist 1.

Eine Immersionslinse (eine Schicht aus Immersionsmedium zwischen Objekt und Linse) erzeugt eine sinnvolle Vergrößerung von 1250x, d. h. die numerische Apertur beträgt 1,25.

Ein verschwommenes oder unscharfes Bild weist darauf hin, dass die nutzbare Vergrößerung größer oder kleiner als die oben genannten Werte ist. Durch Erhöhen oder Verringern des angegebenen Werts wird die Leistung des Mikroskops erheblich beeinträchtigt.

In diesem Artikel haben wir über die Hauptmerkmale eines optischen Mikroskops und Methoden zu deren Berechnung gesprochen. Wir hoffen, dass diese Informationen bei der Arbeit mit diesem komplexen Gerät hilfreich sein werden.

Freunden erzählen

Die Auflösung des Auges ist begrenzt. Auflösung gekennzeichnet aufgelöste Entfernung, d.h. der Mindestabstand zwischen zwei benachbarten Teilchen, bei dem sie noch getrennt sichtbar sind. Der Auflösungsabstand für das bloße Auge beträgt etwa 0,2 mm. Zur Erhöhung der Auflösung wird ein Mikroskop eingesetzt. Um die Struktur von Metallen zu untersuchen, wurde das Mikroskop erstmals 1831 von P.P. Anosov verwendet, der Damaststahl untersuchte, und später, 1863, vom Engländer G. Sorby, der Meteoriteneisen untersuchte.

Der zulässige Abstand ergibt sich aus der Beziehung:

Wo l- Wellenlänge des Lichts, das vom Untersuchungsobjekt zur Linse gelangt, N– Brechungsindex des Mediums zwischen Objekt und Linse und A- Winkelöffnung, die dem halben Öffnungswinkel des Strahlenbündels entspricht, das in das Objektiv eintritt, das das Bild erzeugt. Dieses wichtige Merkmal des Objektivs ist in den Objektivrahmen eingraviert.

U gute Objektive maximaler Öffnungswinkel a = 70° und Sina » 0,94. Die meisten Studien verwenden Trockenobjektive, die an der Luft betrieben werden (n = 1). Um die Auflösungsentfernung zu verringern, werden Immersionslinsen verwendet. Der Raum zwischen Objekt und Linse ist mit einer transparenten Flüssigkeit (Immersion) mit hohem Brechungsindex gefüllt. Normalerweise wird ein Tropfen Zedernöl verwendet (n = 1,51).

Wenn wir für sichtbares weißes Licht l = 0,55 µm annehmen, beträgt der minimale Auflösungsabstand eines Lichtmikroskops:

Daher ist das Auflösungsvermögen eines Lichtmikroskops durch die Wellenlänge des Lichts begrenzt. Das Objektiv vergrößert das Zwischenbild des Objekts, das durch das Okular betrachtet wird, wie durch eine Lupe. Das Okular vergrößert das Zwischenbild des Objekts und kann die Auflösung des Mikroskops nicht erhöhen.

Die Gesamtvergrößerung des Mikroskops entspricht dem Produkt aus der Vergrößerung von Objektiv und Okular. Metallographische Mikroskope werden zur Untersuchung der Struktur von Metallen mit einer 20- bis 2000-fachen Vergrößerung verwendet.

Anfänger machen einen häufigen Fehler, wenn sie versuchen, die Struktur sofort bei hoher Vergrößerung zu betrachten. Es ist zu beachten, dass je größer die Vergrößerung eines Objekts ist, desto kleiner ist der im Sichtfeld des Mikroskops sichtbare Bereich. Daher wird empfohlen, die Studie zunächst mit einer schwachen Linse zu bewerten allgemeiner Charakter Metallkonstruktionen auf einer großen Fläche. Wenn Sie die Mikroanalyse mit einer starken Linse beginnen, werden viele wichtige Merkmale der Metallstruktur möglicherweise nicht bemerkt.

Nach einer Gesamtansicht der Struktur bei geringen Vergrößerungen des Mikroskops wird ein Objektiv mit einer solchen Auflösung ausgewählt, um alle notwendigen kleinsten Details der Struktur zu erkennen.

Das Okular ist so gewählt, dass die durch das Objektiv vergrößerten Details der Struktur deutlich sichtbar sind. Reicht die Okularvergrößerung nicht aus, werden die feinen Details des vom Objektiv erzeugten Zwischenbildes nicht durch das Mikroskop gesehen und somit nicht die volle Auflösung des Objektivs genutzt. Bei einer zu hohen Okularvergrößerung werden neue Strukturdetails nicht sichtbar, gleichzeitig werden die Konturen bereits erkannter Details unscharf und das Sehfeld wird enger. Eigene Steigerung das Okular ist auf seinem Rahmen eingraviert (z. B. 7 x).