Risoluzione e ingrandimento del microscopio. È meglio vedere una volta o un microscopio ad altissima risoluzione. Cosa determina la risoluzione di un microscopio elettronico?

Linee guida

Per studiare oggetti di piccole dimensioni e indistinguibili ad occhio nudo, vengono utilizzati speciali strumenti ottici: i microscopi. A seconda dello scopo, si distinguono: semplificato, funzionante, di ricerca e universale. In base alla fonte di illuminazione utilizzata, i microscopi si dividono in: a luce, a fluorescenza, a ultravioletti, elettronici, a neutroni, a scansione, a tunnel. Il design di uno qualsiasi dei microscopi elencati include parti meccaniche e ottiche. La parte meccanica serve a creare le condizioni di osservazione - posizionando l'oggetto, mettendo a fuoco l'immagine, la parte ottica - ottenendo un'immagine ingrandita.

Dispositivo per microscopio ottico

Un microscopio è chiamato microscopio ottico perché offre la capacità di studiare un oggetto in luce trasmessa in un campo visivo luminoso. (Fig. Vista esterna del Biomed 2) mostra una vista generale del microscopio Biomed-2.

La parte meccanica del microscopio è costituita da una base del microscopio, un tavolino mobile e un dispositivo girevole.

La messa a fuoco su un oggetto si ottiene spostando il tavolino ruotando le manopole di regolazione grossolana e fine.

Il campo di messa a fuoco grossolana del microscopio è di 40 mm.

Il condensatore è montato su una staffa e posizionato tra il tavolino portaoggetti e la lente del collettore. Il suo movimento si effettua ruotando la manopola di regolazione dell'altezza del condensatore. La sua vista generale è mostrata in (Fig.???). Un condensatore a due lenti con un'apertura di 1,25 fornisce l'illuminazione dei campi sull'oggetto quando si lavora con lenti con ingrandimento da 4 a 100 volte.

Il tavolo degli oggetti è montato su una staffa. Il movimento delle coordinate del tavolo degli oggetti è possibile ruotando le maniglie. L'oggetto viene fissato al tavolo tramite portafarmaci. I supporti possono essere spostati l'uno rispetto all'altro.

Le coordinate dell'oggetto e la quantità di movimento sono misurate su scale con un valore di divisione di 1 mm e noni con un valore di divisione di 0,1 mm. L'intervallo di movimento dell'oggetto nella direzione longitudinale è di 60 mm, nella direzione trasversale – 40 mm. Condensatore

Condensatore

Il microscopio è dotato di unità di montaggio del condensatore con possibilità di centraggio e movimento di messa a fuoco.

Il microscopio base utilizza un condensatore universale installato in un supporto; quando si utilizza olio da immersione, l'apertura numerica è 1,25.

Quando si regola l'illuminazione, una variazione graduale dell'apertura numerica del fascio di raggi che illumina il farmaco viene effettuata utilizzando il diaframma di apertura.

Il condensatore viene installato nel portacondensatore in una posizione fissa e fissato con una vite di bloccaggio.

Le viti di centratura del condensatore vengono utilizzate durante il processo di regolazione dell'illuminazione per spostare il condensatore su un piano perpendicolare all'asse ottico del microscopio centrando l'immagine del diaframma di campo rispetto ai bordi del campo visivo.

La maniglia di sollevamento e abbassamento del condensatore, situata sul lato sinistro della staffa del supporto del condensatore, viene utilizzata quando si regola l'illuminazione per mettere a fuoco l'immagine del diaframma di campo.

I filtri sono installati in un anello rotante situato nella parte inferiore del condensatore.

Parte ottica del microscopio

È costituito da sistemi di illuminazione e di osservazione. Il sistema di illuminazione illumina uniformemente il campo visivo. Il sistema di osservazione è progettato per ingrandire l'immagine dell'oggetto osservato.

Sistema di illuminazione

Si trova sotto la tabella degli oggetti. È costituito da una lente collettrice installata nel corpo, che viene avvitata nel foro alla base del microscopio e da una presa con una lampada installata al suo interno. Il portalampada è installato all'interno della base del microscopio. L'illuminatore del microscopio è alimentato da una rete di corrente alternata tramite un cavo di alimentazione a tre pin collegato all'alimentatore tramite una spina. La lampada dell'illuminatore viene accesa da un interruttore situato sulla base del microscopio.

Sistema di osservazione

Composto da lenti, attacco monoculare e oculari.

Lenti a contatto

Le lenti costituiscono la parte più importante, più preziosa e fragile del microscopio. L'ingrandimento, la risoluzione e la qualità dell'immagine dipendono da loro. Sono un sistema di lenti reciprocamente centrate racchiuse in una montatura metallica. All'estremità superiore del telaio è presente una filettatura con la quale l'obiettivo è montato nella presa del revolver. La lente anteriore (più vicina all'oggetto) nell'obiettivo è chiamata lente frontale ed è l'unica nell'obiettivo che produce un ingrandimento. Tutte le altre lenti dell'obiettivo sono chiamate lenti di correzione e servono a correggere le carenze nell'immagine ottica.

Quando un fascio di raggi luminosi con diverse lunghezze d'onda passa attraverso le lenti, si verifica una colorazione arcobaleno dell'immagine: aberrazione cromatica. La rifrazione irregolare dei raggi sulla superficie curva della lente porta all'aberrazione sferica, che si verifica a causa della rifrazione irregolare dei raggi centrali e periferici. Di conseguenza, l'immagine del punto appare come un cerchio sfocato.

Le lenti incluse nel kit del microscopio sono progettate per una lunghezza del tubo ottico di 160 mm, un'altezza di 45 mm e uno spessore del vetro di copertura di mm.

Gli obiettivi con ingrandimenti superiori a 10X sono dotati di telai caricati a molla che proteggono il campione e le lenti anteriori da danni durante la messa a fuoco della superficie del campione.

Sul corpo dell'obiettivo è possibile applicare un anello colorato a seconda dell'ingrandimento, oltre a:

• apertura numerica;
• lunghezza tubo ottico 160;
• spessore del vetro di copertura 0,17, 0 o －";
• tipo di immersione - olio OIL (MI) o acqua VI;

Gli obiettivi contrassegnati con 0,17 sono progettati per lo studio di preparazioni solo con vetrini coprioggetto di spessore 0,17 mm. Gli obiettivi contrassegnati con 0 sono progettati per lo studio delle sole preparazioni senza vetrini coprioggetto. Obiettivi a basso ingrandimento (2,5 - 10), così come obiettivi ad immersione, possono essere utilizzati quando si esaminano preparati con o senza vetrino coprioggetto. Questi obiettivi sono contrassegnati da un'icona －.

Oculari

L'oculare del microscopio è costituito da due lenti: una lente oculare (superiore) e una lente collettrice (inferiore). Tra le lenti c'è il diaframma. Il diaframma blocca i raggi laterali e trasmette quelli vicini all'asse ottico, migliorando il contrasto dell'immagine. Lo scopo dell'oculare è quello di ingrandire l'immagine prodotta dall'obiettivo. Gli oculari hanno il proprio ingrandimento di ×5, ×10, ×12,5, ×16 e ×20, indicato sulla montatura.

La scelta degli oculari dipende dal set di lenti utilizzato. Quando si lavora con lenti acromatiche, acrostigmate e acrofluari, è consigliabile utilizzare oculari con un campo visivo lineare non superiore a 20 mm, con lenti plancromatiche e planapocromatiche - oculari con un campo visivo lineare di 20; 22 e 26,5 mm.

Inoltre il microscopio può essere equipaggiato con un oculare WF10/22 con scala; il valore di divisione della scala è 0,1 mm.

Caratteristiche dei microscopi

Ingrandimento del microscopio

Le caratteristiche principali di un microscopio includono ingrandimento e risoluzione. L'ingrandimento totale fornito da un microscopio è definito come il prodotto dell'ingrandimento dell'obiettivo e dell'ingrandimento dell'oculare. Tuttavia, l'ingrandimento non indica la qualità dell'immagine; può essere chiara o poco chiara. La chiarezza dell'immagine risultante è caratterizzata dalla risoluzione del microscopio, ad es. la dimensione più piccola degli oggetti o delle loro parti che possono essere visti utilizzando questo dispositivo.

L'ingrandimento totale Г del microscopio durante l'osservazione visiva è determinato dalla formula: Г = βok × βok, dove:

βrev - ingrandimento dell'obiettivo (segnato sull'obiettivo); βok - ingrandimento dell'oculare (segnato sull'oculare).

Il diametro del campo osservato nell'oggetto, Add mm, è determinato dalla formula: Add = Add × βob. Doc – diametro del campo visivo oculare (segnato sull'oculare) mm. I valori calcolati dell'ingrandimento del microscopio e del diametro del campo osservato sull'oggetto sono riportati nella Tabella 3.

• Con ordine aggiuntivo

Risoluzione del microscopio

La risoluzione di un microscopio è determinata dalla distanza minima (risolvente) tra due punti (o due linee più sottili) visibili separatamente, e si calcola con la formula

D=λ/(A1+A2) , dove d è la distanza minima (risoluzione) tra due punti (linee); λ è la lunghezza d'onda della luce utilizzata; A1 e A2 sono l'apertura numerica dell'obiettivo (contrassegnata sulla cornice) e del condensatore.

È possibile aumentare la risoluzione (cioè ridurre il valore assoluto di d, poiché si tratta di valori reciproci) nei seguenti modi: illuminare l'oggetto con luce con lunghezza d'onda più corta λ (ad esempio raggi ultravioletti o a onde corte), utilizzare lenti con un'apertura maggiore A1 o aumentare l'apertura del condensatore A2.

Distanza di lavoro dell'obiettivo

I microscopi sono dotati di quattro obiettivi rimovibili con i propri ingrandimenti di 4×, 10×, 40× e 100×, contrassegnati su una struttura metallica. L'ingrandimento dell'obiettivo dipende dalla curvatura della lente anteriore principale: maggiore è la curvatura, minore è la lunghezza focale e maggiore è l'ingrandimento. Questo deve essere ricordato durante la microscopia: maggiore è l'ingrandimento fornito dalla lente, minore è la distanza di lavoro libera e tanto più bassa dovrebbe essere abbassata sopra il piano del campione.

Immersione

Tutte le lenti si dividono in secche e ad immersione, o sommergibili. Una lente è detta asciutta se c'è aria tra la lente anteriore e il campione in questione. In questo caso, a causa della differenza nell’indice di rifrazione del vetro (1,52) e dell’aria (1,0), alcuni raggi luminosi vengono deviati e non entrano nell’occhio dell’osservatore. Gli obiettivi con sistema a secco hanno in genere una lunga lunghezza focale e forniscono un ingrandimento basso (10x) o medio (40x).

Le lenti ad immersione o sommergibili sono quelle lenti in cui un mezzo liquido con un indice di rifrazione vicino all'indice di rifrazione del vetro è posto tra la lente frontale e il campione. L'olio di cedro viene solitamente utilizzato come mezzo di immersione. È possibile utilizzare anche acqua, glicerina, oli trasparenti, monobromonaftalene, ecc. In questo caso si stabilisce un mezzo omogeneo (omogeneo) tra la lente anteriore della lente dell'obiettivo e il preparato (vetro del preparato - olio - vetro della lente) con lo stesso indice di rifrazione. Grazie a ciò, tutti i raggi, senza rifrazione o cambiamento di direzione, entrano nella lente, creando le condizioni per la migliore illuminazione del farmaco. Il valore (n) dell'indice di rifrazione è 1,33 per l'acqua, 1,515 per l'olio di cedro e 1,6 per il monobromonaftalene.

Tecnica della microscopia

Il microscopio si collega alla rete elettrica tramite un cavo di alimentazione. Utilizzando un revolver, nel percorso del raggio viene installata una lente con un ingrandimento di ×10. Un leggero arresto e il clic della molla del revolver indicano che l'obiettivo è montato lungo l'asse ottico. Utilizzando la manopola di messa a fuoco grossolana, abbassare l'obiettivo a una distanza di 0,5 - 1,0 cm dal tavolino.

Regole per lavorare con lenti asciutte.

La preparazione preparata viene posizionata sul palco e fissata con una fascetta. Campi visivi multipli vengono visualizzati utilizzando una lente secca ×10. Il palco viene spostato tramite viti laterali. L'area del farmaco necessaria per l'esame è posta al centro del campo visivo. Sollevare il tubo e, ruotando la rivoltella, spostare la lente con un ingrandimento di 40×, osservando di lato, mediante una vite macrometrica, abbassare nuovamente il tubo con la lente fin quasi a toccare il campione. Guardare nell'oculare e sollevare molto lentamente il tubo finché non appare il contorno dell'immagine. La messa a fuoco precisa viene eseguita utilizzando una vite micrometrica, ruotandola in una direzione o nell'altra, ma non più di un giro completo. Se si avverte resistenza ruotando la vite micrometrica significa che la sua corsa è stata completata. In questo caso, ruotare la vite di uno o due giri completi rovescio, ritrovare l'immagine utilizzando la vite macrometrica e procedere a lavorare con la vite micrometrica.

È utile abituarsi a tenere entrambi gli occhi aperti durante la microscopia e ad usarli alternativamente, poiché questo affaticherà meno la vista.

Quando si cambiano le lenti, non bisogna dimenticare che la risoluzione del microscopio dipende dal rapporto tra l'apertura della lente e quella del condensatore. L'apertura numerica dell'obiettivo con ingrandimento 40x è 0,65 e quella del condensatore non immerso è 0,95. È praticamente possibile metterli in corrispondenza utilizzando la seguente tecnica: dopo aver messo a fuoco il campione con la lente, togliere l'oculare e, guardando attraverso il tubo, coprire il diaframma a iride del condensatore finché i suoi bordi diventano visibili al confine della luce uniformemente visibile. lente posteriore illuminata dell'obiettivo. A questo punto, le aperture numeriche del condensatore e dell'obiettivo saranno approssimativamente uguali.

Regole per lavorare con una lente da immersione.

Sul preparato (preferibilmente fissato e colorato) si applica una piccola goccia di olio da immersione. Il revolver viene ruotato e lungo l'asse ottico centrale viene installata una lente di immersione con un ingrandimento di 100×. Il condensatore viene sollevato fino all'arresto. Il diaframma a iride del condensatore è completamente aperto. Guardando di lato, utilizzare una vite macrometrica per abbassare il tubo fino a immergere la lente nell'olio, quasi fino a quando la lente entra in contatto con il vetrino del campione. Questa operazione deve essere eseguita con molta attenzione in modo che la lente anteriore non si muova e si danneggi. Guardano nell'oculare, ruotano molto lentamente verso di sé la vite macrometrica e, senza sollevare la lente dall'olio, sollevano il tubo finché non compaiono i contorni dell'oggetto. Va ricordato che la distanza di lavoro libera nella lente di immersione è 0,1 - 0,15 mm. Quindi la messa a fuoco precisa viene eseguita utilizzando una vite macrometrica. Nella preparazione vengono esaminati diversi campi visivi, spostando il tavolo con viti laterali. Al termine del lavoro con la lente ad immersione, sollevare il tubo, rimuovere il preparato e pulire accuratamente la lente anteriore della lente, prima con un tovagliolo di cotone morbido asciutto, poi con lo stesso tovagliolo, ma leggermente inumidito con benzina pura. Non lasciare olio sulla superficie dell'obiettivo poiché consente alla polvere di depositarsi e col tempo può danneggiare l'ottica del microscopio. Il preparato viene prima liberato dall'olio con un pezzo di carta da filtro, poi il vetro viene trattato con benzina o xilene.

Come sai, una persona riceve la maggior parte delle informazioni sul mondo che lo circonda attraverso la visione. L'occhio umano è un dispositivo complesso e perfetto. Questo dispositivo creato dalla natura funziona con la luce - radiazione elettromagnetica, la cui lunghezza d'onda è compresa tra 400 e 760 nanometri. Il colore che una persona percepisce cambia dal viola al rosso.

Le onde elettromagnetiche corrispondenti alla luce visibile interagiscono con i gusci elettronici di atomi e molecole nell'occhio. Il risultato di questa interazione dipende dallo stato degli elettroni in questi gusci. La luce può essere assorbita, riflessa o diffusa. Ciò che è accaduto esattamente alla luce può rivelare molto sugli atomi e sulle molecole con cui ha interagito. La gamma di dimensioni di atomi e molecole va da 0,1 a decine di nanometri. Questa è molte volte più corta della lunghezza d'onda della luce. Tuttavia, oggetti proprio di queste dimensioni - chiamiamoli nanooggetti - sono molto importanti da vedere. Cosa è necessario fare per questo? Parliamo prima di ciò che l'occhio umano può vedere.

Di solito, quando si parla della risoluzione dell'uno o dell'altro dispositivo ottico, operare con due concetti. Una è la risoluzione angolare e l'altra è la risoluzione lineare. Questi concetti sono correlati. Ad esempio, per l'occhio umano, la risoluzione angolare è di circa 1 minuto d'arco. In questo caso, l'occhio può distinguere due oggetti puntiformi situati a 25-30 cm di distanza da esso solo quando la distanza tra questi oggetti è superiore a 0,075 mm. Questa è abbastanza paragonabile alla risoluzione di uno scanner per computer convenzionale. Infatti, la risoluzione di 600 dpi significa che lo scanner è in grado di distinguere punti distanti fino a 0,042 mm l'uno dall'altro.

Per poter distinguere oggetti situati a distanze ancora minori l'uno dall'altro, è stato inventato un microscopio ottico, un dispositivo che aumenta la risoluzione dell'occhio. Questi dispositivi hanno un aspetto diverso (come si può vedere dalla Figura 1), ma il loro principio di funzionamento è lo stesso. Il microscopio ottico ha permesso di spingere il limite di risoluzione a frazioni di micron. Già 100 anni fa, la microscopia ottica consentiva di studiare oggetti di dimensioni micrometriche. Tuttavia, allo stesso tempo divenne chiaro che era impossibile ottenere un ulteriore aumento della risoluzione semplicemente aumentando il numero di obiettivi e migliorandone la qualità. La risoluzione di un microscopio ottico si è rivelata limitata dalle proprietà della luce stessa, vale a dire dalla sua natura ondulatoria.

Alla fine del ventesimo secolo si è stabilito che la risoluzione di un microscopio ottico è . In questa formula, λ è la lunghezza d'onda della luce e N peccato tu- l'apertura numerica della lente del microscopio, che caratterizza sia il microscopio che la sostanza che si trova tra l'oggetto di studio e la lente del microscopio ad esso più vicina. Infatti, l'espressione per l'apertura numerica include l'indice di rifrazione N ambiente tra l'oggetto e l'obiettivo e l'angolo tu tra l'asse ottico della lente e i raggi più esterni che escono dall'oggetto e possono entrare in quella lente. L'indice di rifrazione del vuoto è uguale all'unità. Per l'aria questo indicatore è molto vicino all'unità, per l'acqua è 1.33303 e per i liquidi speciali utilizzati in microscopia per ottenere la massima risoluzione, N raggiunge 1,78. Qualunque sia l'angolazione tu, il valore peccato tu non può essere più di uno. Pertanto, la risoluzione di un microscopio ottico non supera una frazione della lunghezza d'onda della luce.

La risoluzione è generalmente considerata pari alla metà della lunghezza d'onda.

L'intensità, la risoluzione e l'ingrandimento di un oggetto sono cose diverse. Puoi fare in modo che la distanza tra i centri delle immagini di oggetti che si trovano a 10 nm l'uno dall'altro sia di 1 mm. Ciò corrisponderebbe ad un incremento di 100.000 volte. Non sarà però possibile distinguere se si tratta di un oggetto o di due. Il fatto è che le immagini di oggetti le cui dimensioni sono molto piccole rispetto alla lunghezza d'onda della luce avranno la stessa forma e dimensione, indipendentemente dalla forma degli oggetti stessi. Tali oggetti sono chiamati oggetti puntiformi: le loro dimensioni possono essere trascurate. Se un oggetto puntiforme si illumina, il microscopio ottico lo rappresenterà come un cerchio luminoso circondato da anelli chiari e scuri. Considereremo inoltre, per semplicità, le sorgenti luminose. Un'immagine tipica di una sorgente luminosa puntiforme ottenuta utilizzando un microscopio ottico è mostrata nella Figura 2. L'intensità degli anelli luminosi è molto inferiore a quella del cerchio e diminuisce con la distanza dal centro dell'immagine. Molto spesso è visibile solo il primo anello luminoso. Il diametro del primo anello scuro è . La funzione che descrive questa distribuzione dell'intensità è chiamata funzione di diffusione dei punti. Questa funzione non dipende dall'ingrandimento. L'immagine di diversi oggetti puntiformi sarà esattamente cerchi e anelli, come si può vedere dalla Figura 3. L'immagine risultante può essere ingrandita, tuttavia, se le immagini di due oggetti puntiformi vicini si uniscono, continueranno a fondersi. Questo tipo di ingrandimento viene spesso considerato inutile: le immagini più grandi risulteranno semplicemente più sfocate. Un esempio di ingrandimento inutile è mostrato nella Figura 4. La formula è spesso chiamata limite di diffrazione, ed è così famosa che è stata scolpita sul monumento all'autore di questa formula, il fisico ottico tedesco Ernst Abbe.

Naturalmente, nel tempo, i microscopi ottici iniziarono ad essere dotati di una varietà di dispositivi che consentivano di memorizzare le immagini. L'occhio umano è stato integrato prima da fotocamere e pellicole, quindi da fotocamere basate su dispositivi digitali che convertono la luce che cade su di esse in segnali elettrici. I più comuni di questi dispositivi sono le matrici CCD (CCD sta per dispositivo ad accoppiamento di carica). Il numero di pixel nelle fotocamere digitali continua ad aumentare, ma questo da solo non può migliorare la risoluzione dei microscopi ottici.

Anche venticinque anni fa sembrava che il limite della diffrazione fosse invalicabile e che per studiare oggetti le cui dimensioni sono molte volte inferiori alla lunghezza d'onda della luce fosse necessario abbandonare la luce in quanto tale. Questo è esattamente il percorso intrapreso dai creatori dei microscopi elettronici e a raggi X. Nonostante i numerosi vantaggi di tali microscopi, rimaneva il problema dell’uso della luce per osservare i nanooggetti. Le ragioni erano molte: comodità e facilità di lavorare con gli oggetti, il breve tempo necessario per ottenere un'immagine, metodi noti per colorare i campioni e molto altro. Finalmente, dopo anni di duro lavoro, è diventato possibile osservare oggetti su scala nanometrica utilizzando un microscopio ottico. I maggiori progressi in questa direzione sono stati raggiunti nel campo della microscopia a fluorescenza. Naturalmente nessuno ha cancellato il limite di diffrazione, ma sono riusciti ad aggirarlo. Attualmente esistono diversi microscopi ottici che consentono di esaminare oggetti le cui dimensioni sono molto più piccole della lunghezza d'onda della luce stessa che crea le immagini di questi oggetti. Tutti questi dispositivi hanno una cosa in comune principio generale. Proviamo a spiegare quale è.

Da quanto già detto riguardo il limite di risoluzione della diffrazione, è chiaro che vedere una sorgente puntiforme non è poi così difficile. Se questa sorgente è di intensità sufficiente, la sua immagine sarà chiaramente visibile. La forma e la dimensione di questa immagine, come già accennato, saranno determinate dalle proprietà del sistema ottico. Allo stesso tempo, conoscendo le proprietà del sistema ottico ed essendo sicuri che l'oggetto sia un oggetto puntiforme, puoi determinare esattamente dove si trova l'oggetto. La precisione nel determinare le coordinate di un tale oggetto è piuttosto elevata. Ciò può essere illustrato dalla Figura 5. Le coordinate di un oggetto puntiforme possono essere determinate con maggiore precisione, quanto più intensamente si illumina. Negli anni '80 del secolo scorso, utilizzando un microscopio ottico, furono in grado di determinare la posizione delle singole molecole luminose con una precisione di 10-20 nanometri. Una condizione necessaria per una determinazione così accurata delle coordinate di una sorgente puntiforme è la sua solitudine. L'altra sorgente puntiforme più vicina deve essere così lontana che il ricercatore sappia con certezza che l'immagine elaborata corrisponde a una sorgente. È chiaro che questa è una distanza l deve soddisfare la condizione. In questo caso l'analisi delle immagini può fornire dati molto precisi sulla posizione della sorgente stessa.

La maggior parte degli oggetti le cui dimensioni sono molto inferiori alla risoluzione di un microscopio ottico possono essere rappresentati come un insieme di sorgenti puntiformi. Le sorgenti luminose in un tale set si trovano l'una dall'altra a distanze molto inferiori a . Se queste fonti brillano contemporaneamente, sarà impossibile dire nulla su dove si trovano esattamente. Tuttavia, se riesci a far brillare queste fonti una dopo l'altra, la posizione di ciascuna di esse può essere determinata con elevata precisione. Se questa precisione supera la distanza tra le sorgenti, allora, conoscendo la posizione di ciascuna di esse, si può scoprire quali sono le loro posizioni relative. Ciò significa che sono state ottenute informazioni sulla forma e le dimensioni dell'oggetto, che viene presentato come un insieme di sorgenti puntiformi. In altre parole, in questo caso potete esaminare un oggetto con un microscopio ottico le cui dimensioni sono inferiori al limite di diffrazione!

Pertanto, il punto chiave è ottenere informazioni sulle diverse parti di un nanooggetto indipendentemente le une dalle altre. Esistono tre gruppi principali di metodi per farlo.

Il primo gruppo di metodi fa risplendere intenzionalmente l'una o l'altra parte dell'oggetto studiato. Il più noto di questi metodi è la microscopia ottica a scansione in campo vicino. Diamo un'occhiata più da vicino.

Se studi attentamente le condizioni implicite quando parli del limite di diffrazione, scoprirai che le distanze dagli oggetti alle lenti sono molto maggiori della lunghezza d'onda della luce. A distanze paragonabili e inferiori a questa lunghezza d'onda, il quadro è diverso. Vicino a qualsiasi oggetto catturato nel campo elettromagnetico di un'onda luminosa, c'è un campo elettromagnetico alternato, la cui frequenza di cambiamento è uguale alla frequenza di cambiamento del campo nell'onda luminosa. A differenza di un’onda luminosa, questo campo decade rapidamente man mano che si allontana dal nanooggetto. La distanza alla quale l'intensità diminuisce, ad es. e volte, paragonabili alla dimensione dell'oggetto. Pertanto, il campo elettromagnetico della frequenza ottica è concentrato in un volume di spazio, la cui dimensione è molto più piccola della lunghezza d'onda della luce. Qualsiasi nanooggetto che cade in quest'area interagirà in un modo o nell'altro con il campo concentrato. Se l'oggetto con l'aiuto del quale viene effettuata questa concentrazione di campo viene spostato in sequenza lungo qualsiasi traiettoria lungo il nanooggetto studiato e viene registrata la luce emessa da questo sistema, allora è possibile costruire un'immagine dai singoli punti che giacciono su questa traiettoria. Naturalmente, in ogni punto l'immagine apparirà come mostrato nella Figura 2, ma la risoluzione sarà determinata da quanto il campo era concentrato. E questo, a sua volta, è determinato dalla dimensione dell'oggetto con l'aiuto del quale si concentra questo campo.

Il modo più comune per concentrare il campo in questo modo è praticare un foro molto piccolo in uno schermo metallico. In genere, questo foro si trova all'estremità di una guida luminosa appuntita rivestita con una sottile pellicola di metallo (la guida luminosa è spesso chiamata fibra ottica ed è ampiamente utilizzata per la trasmissione di dati su lunghe distanze). Ora è possibile produrre fori con diametri da 30 a 100 nm. La risoluzione è la stessa in termini di dimensioni. I dispositivi che funzionano secondo questo principio sono chiamati microscopi ottici a scansione in campo vicino. Sono apparsi 25 anni fa.

L'essenza del secondo gruppo di metodi si riduce a quanto segue. Invece di far brillare a turno i nanooggetti vicini, puoi usare oggetti che brillano di colori diversi. In questo caso, con l'aiuto di filtri luminosi che trasmettono la luce di un colore o di un altro, puoi determinare la posizione di ciascun oggetto e quindi creare un'unica immagine. Questo è molto simile a quanto mostrato nella Figura 5, solo i colori saranno diversi per le tre immagini.

L'ultimo gruppo di metodi che permettono di superare il limite di diffrazione ed esaminare i nanooggetti sfrutta le proprietà degli oggetti luminosi stessi. Esistono fonti che possono essere "accese" e "spente" utilizzando una luce appositamente selezionata. Tali commutazioni avvengono statisticamente. In altre parole, se ci sono molti nanooggetti commutabili, selezionando la lunghezza d'onda della luce e la sua intensità, è possibile forzare lo “spegnimento” solo di una parte di questi oggetti. Gli oggetti rimanenti continueranno a brillare e da essi sarà possibile ottenere un'immagine. Successivamente è necessario “accendere” tutte le fonti e “spegnerne” nuovamente alcune. L'insieme di sorgenti che rimangono “accese” sarà diverso dall'insieme che è rimasto “acceso” la prima volta. Ripetendo questa procedura più volte, puoi ottenere grande insieme immagini diverse tra loro. Analizzando un tale insieme, è possibile localizzare gran parte di tutte le sorgenti con una precisione molto elevata, ben al di sopra del limite di diffrazione. Un esempio di superrisoluzione ottenuta in questo modo è mostrato in Figura 6.

La microscopia ottica a super risoluzione si sta attualmente sviluppando rapidamente. È lecito ritenere che quest’area attirerà un numero crescente di ricercatori nei prossimi anni e speriamo che i lettori di questo articolo siano tra questi.

Elena3013

Questo articolo discuterà l'ingrandimento di un microscopio, le unità di misura di questa quantità e i metodi per determinare visivamente il potere risolutivo del dispositivo. Parleremo anche dei parametri standard di questo valore e dei metodi per calcolare l'aumento per un tipo specifico di lavoro.

Molto spesso, i principali parametri di potenza del microscopio sono indicati sul corpo dell'obiettivo. Svitare la lente e ispezionarla. Puoi vedere due numeri scritti come una frazione. Il primo è l'ingrandimento, il secondo è l'apertura numerica.

L'apertura caratterizza la capacità del dispositivo di raccogliere la luce e produrre un'immagine chiara. La lente può anche indicare la lunghezza del tubo e lo spessore del vetro di copertura necessari per il lavoro.

Tutto sull'ingrandimento del microscopio

L'ingrandimento è misurato in multipli (x). Il rapporto del sistema oculare-lente determina completamente il suo significato. Il prodotto dell'ingrandimento dell'oculare e dell'obiettivo ci dice l'ingrandimento di lavoro creato da un dato microscopio. La dipendenza dell'ingrandimento totale dall'ingrandimento dell'obiettivo è evidente. In base alla potenza, le lenti si dividono nei seguenti gruppi:

Piccolo (non più di 10x);

Medio (fino a 50x);

Grandi (oltre 50x);

Extra large (più di 100x).

Il valore massimo di ingrandimento dell'obiettivo per un microscopio ottico è 2000x. Il valore dell'oculare è solitamente 10x e cambia raramente. Ma l'ingrandimento dell'obiettivo varia ampiamente (da 4 a 100x e 2000x).

Quando si sceglie un microscopio, è necessario considerare chi lo utilizzerà e quale ingrandimento massimo potrebbe essere necessario. Ad esempio, per un bambino in età prescolare 200x è sufficiente, i microscopi scolastici e universitari hanno un ingrandimento di 400-1000x. Ma il dispositivo di ricerca dovrebbe fornire almeno 1500-2000x. Questo valore consente di lavorare con batteri e piccole strutture cellulari.

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Risoluzione del dispositivo

Cosa determina la chiarezza e la qualità dell'immagine prodotta da un microscopio? Ciò è influenzato dalla risoluzione del dispositivo. Per calcolare questa quantità, è necessario trovare il quoziente tra la lunghezza d'onda della luce e due aperture numeriche. Pertanto, è determinato dal condensatore e dalla lente del microscopio. Ti ricordiamo che il valore numerico dell'apertura è visibile sul barilotto dell'obiettivo. Più è alto, migliore è la risoluzione del dispositivo.

Il microscopio ottico ha un limite di risoluzione di 0,2 micron. Questa è la distanza minima dall'immagine quando tutti i punti dell'oggetto sono distinguibili.

Ingrandimento utile al microscopio

Si parla di ingrandimento utile quando l'occhio del ricercatore sfrutta appieno il potere risolutivo del microscopio. Ciò si ottiene osservando l'oggetto con l'angolo massimo consentito. L'ingrandimento utile dipende solo dall'apertura numerica e dal tipo di obiettivo. Nel calcolarlo, l'apertura numerica aumenta di 500-1000 volte.

Una lente asciutta (solo aria tra l'oggetto e la lente) crea un ingrandimento utile di 1000x, cioè NA è 1.

Una lente ad immersione (uno strato di mezzo di immersione tra l'oggetto e la lente) crea un ingrandimento utile di 1250x, ovvero l'apertura numerica è 1,25.

Un'immagine sfocata o indistinta indica che l'ingrandimento utilizzabile è maggiore o minore dei valori sopra indicati. L'aumento o la diminuzione del valore specificato riduce significativamente le prestazioni del microscopio.

In questo articolo abbiamo parlato delle principali caratteristiche di un microscopio ottico e dei metodi per calcolarle. Ci auguriamo che queste informazioni siano utili quando si lavora con questo dispositivo complesso.

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La risoluzione dell'occhio è limitata. Risoluzione caratterizzato distanza risolta, cioè. la distanza minima tra due particelle vicine alla quale sono ancora visibili separatamente. La distanza risolta ad occhio nudo è di circa 0,2 mm. Un microscopio viene utilizzato per aumentare la risoluzione. Per studiare la struttura dei metalli, il microscopio fu utilizzato per la prima volta nel 1831 da P.P. Anosov, che studiò l'acciaio damascato, e successivamente, nel 1863, dall'inglese G. Sorby, che studiò il ferro meteoritico.

La distanza consentita è determinata dalla relazione:

Dove l- lunghezza d'onda della luce proveniente dall'oggetto di studio all'obiettivo, N– indice di rifrazione del mezzo situato tra l'oggetto e la lente, e UN- apertura angolare pari alla metà dell'angolo di apertura del fascio di raggi entranti nella lente che produce l'immagine. Questa importante caratteristica della lente è incisa sulla montatura della lente.

U buone lenti angolo di apertura massimo a = 70° e sina » 0,94. La maggior parte degli studi utilizza obiettivi asciutti operanti in aria (n = 1). Per ridurre la distanza risolta vengono utilizzate lenti ad immersione. Lo spazio tra l'oggetto e la lente è riempito con un liquido trasparente (immersione) ad alto indice di rifrazione. Tipicamente viene utilizzata una goccia di olio di cedro (n = 1,51).

Se prendiamo l = 0,55 µm per la luce bianca visibile, la distanza di risoluzione minima di un microscopio ottico è:

Pertanto, il potere risolutivo di un microscopio ottico è limitato dalla lunghezza d'onda della luce. La lente ingrandisce l'immagine intermedia dell'oggetto, che viene vista attraverso l'oculare, come attraverso una lente d'ingrandimento. L'oculare ingrandisce l'immagine intermedia dell'oggetto e non può aumentare la risoluzione del microscopio.

L'ingrandimento totale del microscopio è uguale al prodotto dell'ingrandimento dell'obiettivo e dell'oculare. I microscopi metallografici vengono utilizzati per studiare la struttura dei metalli con ingrandimenti da 20 a 2000 volte.

I principianti commettono un errore comune cercando di visualizzare immediatamente la struttura ad alto ingrandimento. Va tenuto presente che maggiore è l'ingrandimento di un oggetto, minore è l'area visibile nel campo visivo del microscopio. Pertanto, si consiglia di iniziare lo studio utilizzando una lente debole per effettuare una prima valutazione carattere generale strutture metalliche su una vasta area. Se si avvia la microanalisi utilizzando una lente potente, è possibile che molte caratteristiche importanti della struttura metallica non vengano notate.

Dopo una visione generale della struttura a basso ingrandimento del microscopio, viene selezionata una lente con tale risoluzione per vedere tutti i più piccoli dettagli necessari della struttura.

L'oculare è scelto in modo che i dettagli della struttura, ingranditi dalla lente, siano chiaramente visibili. Se l'ingrandimento dell'oculare non è sufficiente, i dettagli fini dell'immagine intermedia creata dall'obiettivo non verranno visti al microscopio e quindi non verrà utilizzata l'intera risoluzione dell'obiettivo. Se l'ingrandimento dell'oculare è troppo elevato, i nuovi dettagli strutturali non verranno rivelati, allo stesso tempo i contorni dei dettagli già identificati saranno sfocati e il campo visivo si restringerà. Proprio aumento l'oculare è inciso sulla sua cornice (ad esempio, 7 x).